Vorming van disulfidebindingen en uitsluiting cysteïne in gram-positieve bacteriën

Chemie Admin December 16, 2016 0 23
FONT SIZE:
fontsize_dec
fontsize_inc

Hoewel verschillende mechanismen bekend voor vele Gram-negatieve bacteriën en hun eiwitten zijn aangepast aan de uitdagingen door oxidatieve omgevingen zeer weinig bekend over hoe gram-positieve bacteriën zijn ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. Om dit probleem op te lossen, verwachtten we de subcellulaire lokalisatie van ~ 1.000.000 bacteriële eiwitten door middel van geautomatiseerde analyse en onderzocht hun respectieve cysteïne integratie modellen om mogelijke strategieën van deze bacteriën zijn uitgegroeid tot identificeren reactie op oxidatieve druk hun eiwitten. Verder hebben we bepaalden de gevoeligheid van een aantal bacteriesoorten het verminderen van DTT, zocht hij naar disulfide-gebonden eiwitten door tweedimensionale niet-reducerende / reducerende SDS-PAGE, en die twee tegenhangers dimeer Actinobacterial DSB in staat om productief oxidatie. Samen onze voorspellende en experimentele resultaten, gecombineerd met die van eerdere studies (16, 27, 28), suggereren sterk dat aerobe Gram-positieve Actinobacteria bekwaam om disulfidebindingen gereguleerd vormen, terwijl Firmicutes niet. In plaats daarvan, Firmicutes aerobic grotendeels uitsluiten cysteïneresten zowel van hen en cytoplasma geëxporteerd eiwitten.

De complexiteit van het buigproces is grotendeels afhankelijk van het milieu en de aminozuursamenstelling van een eiwit. oxidatieve omgevingen zijn een uitdaging voor eiwitten die cysteïne vanwege hun gevoeligheid voor reactieve aanvallen soorten van zuurstof (15, 40, 41). Om dit probleem te verminderen, worden de Gram-negatieve bacteriën waarvan bekend is behouden hun cytoplasma in een toestand verminderd met thioredoxine en glutaredoxin systemen (42, 43). In hun periplasma, het ligt een oplosbaar enzym (DsbA), die samenwerkt met de DsbB plasmamembraan op weg naar katalyseren vorming van disulfidebindingen in de geëxporteerde eiwitten, hetgeen de stabiliteit verhoogt en beschermt tegen schadelijke oxidatie (16, 17).

twee verschillende strategieën zijn gevonden als Gram-positieve bacteriën pakken milieudruk dat begeleidt locatie van hun eiwitten. Zoals eerder opgemerkt Dutton et al. (27), elk rijpen strategie correleert met een specifieke cysteine ​​incorporatie model hangt af van of het proteoom komen uit de phyla Firmicutes of Actinobacteria. Firmicutes lijkt een eenvoudige en unieke wijze om te gaan met de oxidatieve druk op hun uitvoer eiwitten die we "uitsluiting cysteine."

uitsluiting

cysteïne kan zijn geëvolueerd van een selectief voordeel van de groei; Echter, de uitvoering ervan als een beveiligingsstrategie Blijkt op basis van de volgende resultaten. (I) statuten cysteïne patronen verschillen tussen aërobe en anaërobe Firmicutes; (Ii) vergeleken Actinobacteria en Gram-negatieve bacteriën, Firmicutes een hoge tolerantie voor inkorting het groeimedium; en (iii) de cysteïne residuen die disulfide bindingen in klasse A beta-lactamase en alkalische fosfatase bewaard vormen Gram-negatieve bacteriën zijn niet in vele Firmicutes aërobe tegenhangers (27, 44, -, 47). Derhalve kunnen de eiwitten uitgevoerde Firmicutes aërobe cysteïnen bevatten, zoals lipoproteïnen en enzymen sortase die betrokken zijn bij pilus biogenese, doe het als een functionele eis; anders zouden ze zijn uitgesloten.

Vervolgens gekenmerkt twee eiwitten van de disulfide titels als C. glutamicum en vond dat één (GC26) wordt vastgehouden binnen de stam van Actinobacteria. Zoals het oxidoreductase in Actinobacterium Mycobacterium tuberculosis, die werd geïdentificeerd door homologie DSBE (48), deze enzymen niet volledig homoloog zijn aan de klassieke DsbA door Gram-negatieve bacteriën. De sequentieverschillen (~ 15% van de Identity) en de oligomere toestand van E. coli DsbA suggereren dat, als een groep, deze enzymen moeten worden als Actinobacterial of A-DsbA geclassificeerd. Samen vormen deze resultaten geven aan dat zelfs indien homologie zoekopdrachten zijn bruikbaar voor het identificeren van enzymen de vorming van de mogelijke disulfidebinding (16, 27, 28), experimentele validatie essentieel om te bevestigen dat deze eiwitten werken als verwacht (41).

Het feit dat de enzymen A-DsbA niet bestaan ​​als een dimeer en een monomeer zoals E. coli DsbA heeft verschillende functionele implicaties. De dimerisatie van A-DsbA veroorzaakt mogelijk specificiteit voor zijn membraangebonden Partners en werpt ook twee actieve plaats Cys-X-X-cis in de onmiddellijke omgeving, waarin het eiwit disulfide isomerase eukaryote woonachtig bootst in het endoplasmatisch patroon (49). Het belangrijkste verschil is dat proteïne disulfide-isomerasen zijn monomere eiwitten met twee actieve plaatsen Cys-X-X-cys. Het werd onlangs voorgesteld dat homologen van vitamine K epoxide reductase opladen Actinobacterial DsbA naar de plasmamembraan (27, 50). Het vitamine K epoxide reductase die is voorgesteld recyclen A-DsbA ook potentieel analogie eukaryote oxidatie, want er zijn tegenhangers in het endoplasmatisch reticulum (27, 50). Dus, kan vorming van disulfidebindingen in Actinobacteria meer evolutionair verwant zijn eukaryoten dan gramnegatieve bacteriën, wat suggereert dat eukaryote tegenhangers vitamine K epoxide reductase verantwoordelijk voor proteïne disulfide-opladen kan isomerase.

Een intrigerend concept dat voortvloeit uit deze studie is dat Firmicutes ook welkom cysteïne uitsluiting in hun cytoplasmatische eiwitten. Dit suggereert dat aërobe Firmicutes een hoog niveau van oxidatieve druk hun cytoplasmatische eiwitten kunnen hebben. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het buitenmembraan, dat afwezig is in Firmicutes, voorziet een verdere permeabiliteit barrière die helpt bij het reguleren van cytoplasma redox omstandigheden.

Deze resultaten geven aan dat aërobe Actinobacteria waarschijnlijk bezitten een regelbare compartiment dat het mechanisme van bevat disulfide binding (27, 48). Ter ondersteuning hiervan hebben cryo-electron tomografie studies aangetoond dat mycolzuren covalent gebonden aan de peptidoglycan van Actinobacteria maak een externe membraan-achtige structuur die afwezig is in Firmicutes (51, 52). Derhalve blijkt de aanwezigheid van een buitenste membraan een drijvende kracht naar een systeem dat disulfide vergemakkelijkt ontwikkeling vorming van de band met de oprichting van een buiging gereguleerde omgeving die co-lokaliseert de enzymen en substraten.

Firmicutes zoals B. subtilis, S. aureus, E. faecalis en Listeria monocytogenes werden eerder gerapporteerd homologen van DsbA coderen door Gram-negatieve bacteriën (16, 27, 28). Hiervan B. subtilis is de enige Firmicutes die ook codeert DsbB en welke substraten zijn geïdentificeerd, maar geen van deze twee substraten Ze zijn betrokken bij essentiële processen (53, -, 57). Bij S. aureus, waarin hun identiteit disulfide gebonden substraten, wordt de lipoproteïne tegenhanger van DsbA gedacht zelfstandig functioneren gebruik extracellulaire oxidanten oog op recycling in afwezigheid van DsbB (28, 58, 59). Onze analyse in combinatie met het bestaan ​​van slechts twee substraten die bezitten enzym gekatalyseerde gevalideerde disulfidebindingen, benadrukt dat Firmicutes algemeen uitsluiten cysteïnen van hun geëxporteerde eiwitten. Zo, de weinige die Firmicutes bevatten DsbA en DsbB tegenhangers waarschijnlijk gebruik voor vorming van disulfidebindingen in eiwitten met niet-essentiële niche functies.

Vanuit evolutionair oogpunt, met uitzondering van cysteïne biedt waarschijnlijk een selectief voordeel in omgevingen redox extremen, mogelijk verklaren waarom Firmicutes zijn oververtegenwoordigd onder de bacteriën die koloniseren en infecteren zuurstof blootgesteld weefsels zoals de huid en de luchtwegen (60). Dit wordt ondersteund door onze ontdekking dat sterke Firmicutes reduceren tolereren en doordat pathogenen zoals Firmicutes Streptococcus pneumoniae actief produceren hoge niveaus van de krachtige oxidant waterstofperoxide (61). Bovendien kan de eenvoudige cysteïne uitsluiting strategie Firmicutes te voorzien van een zekere bescherming tegen de basis van oxidatie- immuniteit van gastheer-pathogeen-interface gebruikt door neutrofielen en macrofagen. Aan de negatieve kant, het onvermogen van Firmicutes vangen cysteïneresiduen kan een belemmering voor laterale genoverdracht maken, waardoor de variabiliteit van hun uitvoer eiwitten, die de meerderheid van bacteriële virulentiefactoren vormen. Echter, recente studies hebben aangetoond dat Firmicutes ook de structurele stabiliteit van hun eiwitten kunnen behouden worden uitgevoerd met behulp van alternatieve covalente bindingen, die waarschijnlijk bijdraagt ​​aan hun vermogen om cysteïnen sluiten (62). Hoewel het duidelijk is dat Firmicutes in het algemeen niet over de opleidingscapaciteit van de disulfidebinding, verder onderzoek in als ze beschermen hun kleine eiwit wordt uitgevoerd door een enkel cysteïnen reductase systeem dat functioneel gelijk is die onlangs in E. coli beschreven gerechtvaardigd (19).

(0)
(0)